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Step 1
Step 2
Step 3
为验证LeviCell™系统的性能表现,将PBMCs细胞重新悬浮在悬浮液中,并使用LeviCell™富集活细胞。使用PI将通道(上)(Live Channel)和通道(下)(Dead Channel)产物及未分选样本进行染色,并在 Sony®SH800S 流式细胞分选仪上进行后续分析。
如下图所示,与未分选样本(LeviCell™分选前)相比,通道(上)(Live Channel)显示出近三倍的富集度(活力为 87%),而后者显示的活力为 31%。通道(下)(Dead Channel)中含有 96% 的死细胞。这明确证实了 LeviCell™技术平台能够最大程度地提高细胞活性及去除细胞碎片。
对细胞群表征无负面影响
为展示LeviCell™温和的处理过程(在不影响原始样本细胞群表征的情况下获得稳定得率),将PBMCs细胞悬浮在Levitation Agent™中,并用LeviCell™富集活细胞。部分原始样本单独分析。使用TruStain human Fc Block 将通道(上)(Live Channel)和通道(下)(Dead Channel)产物以及未分选样本在室温下封闭15分钟后,再加入抗-CD45 (PE)、抗-CD3 (FITC) 和抗-CD11b (APC) 各5 μL及抗-CD19 (PerCP- Cy5.5) 10 μL染色,置于冰浴中放置1小时。接着使用FACS缓冲液(含有0.5% BSA的PBS)清洗样本一次,再用Sony SH800S分析。
如图示,通道(上)(Live Channel)产物显示,在 CD45+ 淋巴细胞群中,CD3+、CD19+和CD11b+细胞数与分选前(Input)相当。所有类型的细胞都能保持稳定的活细胞产量充分证明了LeviCell™平台快速、温和、高效的分选技术能够保持原始细胞群表征。
不影响处理后活化状态
使用敏感型巨噬细胞进行分选和富集实验验证了LeviCell™能够分选细胞且不会影响细胞的活化状态。巨噬细胞可被极化为两种主要状态:M1(可促发炎症)和M2(可消除炎症)。分别使用IFN-γ (50 ng/mL) 和IL-4 (20 ng/mL) 处理巨噬细胞(在含有10% FBS的DMEM缓冲液中培养)24小时。使用未处理的巨噬细胞 (M0) 作为对照。
在进入LeviCell™时,巨噬细胞每种极性状态的初始细胞活力为20%。分别进行三次实验,观察到分选后富集的细胞活力为88% – 100%。富集后采用qRT – PCR处理来检测这些细胞中显示M1和M2活化状态的基因表达,以表明它们的活化状态没有受到LeviCell™分选的影响。
对于所有活化状态,在加入样本和分选后细胞间未观察到明显的基因表达差异。这表明,LeviCell™的分选过程足够温和,可在不影响巨噬细胞等敏感型细胞的极化状态下进行分选。